Cromatografía líquida desnaturalizante de alta resolución (DHPLC) para la detección y el seguimiento de bacterias viables no cultivables (BVNC)

Abstract

La tecnología de cromatografía líquida de alta resolución (DHPLC) se utiliza en diagnóstico e investigación de tumores y enfermedades genéticas (Frueh et al., 2003; Xiao et al., 2001). Recientemente se ha comenzado a trabajar con ella en identificación y seguimiento de poblaciones microbianas. Los protocolos de trabajo en el equipo se han adaptado para discriminar diferencias en distintos genes bacterianos. Los fragmentos de genes de interés amplificados por PCR se pasan a través de la columna del equipo que contiene partículas de poliestireno / polidivinilbenceno. La separación de los productos de PCR se basa en la elución mediante acetato de triethylammonium (TEAA) de moléculas de ADN parcialmente desnaturalizadas por la temperatura. Las muestras de ADN bacteriano con variaciones de la secuencia muestran diferencias en los tiempos de retención. Hay algunos factores clave para el éxito en la detección de variantes genéticas bacterianas en DHPLC: diseño de cebador de PCR, protocolo de PCR, gradiente de separación y la temperatura (Barlaan et al., 2006).