Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares enriquecidas en exosomas en pacientes españoles con enfermedad de Dent 1

Abstract

Enfermedad de Dent; Exosomas; Vesículas extracelulares

Dent's disease; Exosomes; Extracelular vesicles

Malaltia de Dent; Exosomes; Vesícules extracel·lulars

Antecedentes y objetivo La enfermedad de Dent tipo 1 (DD1) es una enfermedad hereditaria rara ligada al cromosoma X causada por mutaciones en el CLCN5 que se caracteriza principalmente por una disfunción del túbulo proximal, hipercalciuria, nefrolitiasis o nefrocalcinosis, enfermedad renal crónica progresiva y proteinuria de bajo peso molecular, rasgo distintivo de la enfermedad. En la actualidad no existe un tratamiento curativo específico, únicamente sintomático, y no previene la progresión de la enfermedad. En este estudio hemos aislado y caracterizado las vesículas extracelulares urinarias (uEV) enriquecidas en exosomas que nos permitirán identificar biomarcadores asociados a la progresión de DD1 y ayudarán a una mejor comprensión de las bases fisiopatológicas. Materiales y métodos A través de una convocatoria nacional de la Sociedad Española de Nefrología (SEN) y la Sociedad Española de Nefrología Pediátrica (AENP), se obtuvieron orinas de pacientes y controles de distintos hospitales españoles, las cuales se procesaron para obtener los uEV. Los datos de estos pacientes fueron proporcionados por los respectivos nefrólogos o extraídos del registro RENALTUBE. Los uEV se aislaron mediante ultracentrifugación, fueron caracterizados morfológicamente y se extrajo su contenido de proteína y micro-ARN. Resultados Se seleccionó a 25 pacientes y 10 controles, de los cuales se procesaron las orinas para aislar los uEV. Nuestros resultados mostraron que la concentración relativa de uEV/ml era menor en los pacientes que en los controles (0,26 × 106 vs. 1,19 × 106 uEV/ml; p < 0,01). Además, se vio que los uEV de los pacientes eran significativamente más grandes que los de los sujetos control (diámetro medio: 187,8 vs. 143,6 nm; p < 0,01). Por último, nuestros datos demostraron que se había extraído correctamente el ARN tanto de los exosomas de pacientes como de los controles. Conclusiones En este trabajo describimos el aislamiento y caracterización de uEV de pacientes con DD 1 y controles sanos, útiles para el posterior estudio de moléculas cargo diferencialmente expresadas en esta enfermedad.

Background and objectives Dent's disease type 1 (DD1) is a rare X-linked hereditary pathology caused by CLCN5 mutations that is characterized mainly by proximal tubule dysfunction, hypercalciuria, nephrolithiasis/nephrocalcinosis, progressive chronic kidney disease, and low-weight proteinuria, the molecular hallmark of the disease. Currently, there is no specific curative treatment, only symptomatic and does not prevent the progression of the disease. In this study we have isolated and characterized urinary extracellular vesicles (uEVs) enriched in exosomes that will allow us to identify biomarkers associated with DD1 progression and a better understanding of the pathophysiological bases of the disease. Materials and methods Through a national call from the Spanish Society of Nephrology (SEN) and the Spanish Society of Pediatric Nephrology (AENP), urine samples were obtained from patients and controls from different Spanish hospitals, which were processed to obtain the uEVs. The data of these patients were provided by the respective nephrologists and/or extracted from the RENALTUBE registry. The uEVs were isolated by ultracentrifugation, morphologically characterized and their protein and microRNA content extracted. Results Twenty-five patients and 10 controls were recruited, from which the urine was processed to isolate the uEVs. Our results showed that the relative concentration of uEVs/ml is lower in patients compared to controls (0.26 × 106 vs. 1.19 × 106 uEVs/ml, P < 0.01). In addition, the uEVs of the patients were found to be significantly larger than those of the control subjects (mean diameter: 187.8 vs. 143.6 nm, P < 0.01). Finally, our data demonstrated that RNA had been correctly extracted from both patient and control exosomes. Conclusions In this work we describe the isolation and characterization of uEVs from patients with DD1 and healthy controls, that shall be useful for the subsequent study of differentially expressed cargo molecules in this pathology.

Este trabajo ha sido financiado principalmente por la fundación SENEFRO (SEN2019 a AM), por ASDENT y por subvenciones del Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF201789989 a AM) y de la Red de Investigación Renal REDinREN (12/0021/0013). El Grupo de Fisiopatología Renal tiene la Mención de Calidad de la Generalitat de Cataluña (2017 SGR).