MEMORIA FINAL DEL PROYECTO INIA SC97-131-C2-2,

“ETIOLOGÍA DE ENFERMEDADES ASOCIADAS AL DECAIMIENTO DEL PERAL. MEJORA DE TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE FITOPLASMAS”

 

 Índice

 

1.-Introducción

2.-Planteamiento y desarrollo de las actividades realizadas

3.-Grado de consecución de los objetivos

4.-Conclusiones y resultados alcanzados

5.-Aplicación al sector y posible difusión de resultados

6.-Colaboraciones y ayudas recibidas o prestadas

7.-Vinculación del proyecto a programas de cooperación científica y técnica internacional; entidades extranjeras con las que se ha cooperado: financiación y cuantía, en su caso, y utilización de resultados alcanzados.

 

 

 

 

1.-INTRODUCCIÓN

 

El fitoplasma causante de la enfermedad del decaimiento del peral o Pear decline (PD) había sido descrito en nuestro país, pero se desconocía la incidencia real del patógeno, ya que las sintomatologías observadas se confundían a menudo con otros patógenos o con posibles desordenes fisiológicos. Se propuso realizar un estudio conducente a discernir la presencia del PD de otros agentes afines, así como determinar su incidencia y distribución por variedades y patrones en el área frutícola de Cataluña y Cuenca del Ebro. Así mismo, para un adecuado control de la enfermedad era necesario conocer cuales eran las especies de insectos vectores de la enfermedad en la zona y conocer si existía un único aislado del fitoplasma o por el contrario existía variabilidad genética del mismo. Se desconocía si la distinta expresión de síntomas observada era debida a variabilidad genética del fitoplasma o a una respuesta varietal. En el momento de iniciarse el proyecto únicamente dos especies del género Cacopsylla habían sido identificadas como vectores de la enfermedad C. pyricola y C. pyrisuga, aunque se sospechaba que C. pyri también era probablemente vector de la enfermedad, ya que era la especie más abundante en los países mediterráneos y se habían identificado individuos de esta especie portadores del fitoplasma. Por otro lado, la dificultad de diagnosticar las enfermedades producidas por fitoplasmas era también uno de los principales problemas para su control. La técnica de la PCR aunque era la más sensible, resultaba poco asequible para la aplicación rutinaria en empresas o para la certificación de material vegetal. Los principales problemas eran debidos a la complejidad del proceso de extracción del ADN, especialmente en leñosas y muy especialmente en peral, donde la presencia de inhibidores interfiere a menudo en el desarrollo de la PCR. Por estos motivos se planteó la mejora de las técnicas de detección para este fitoplasma y la puesta a punto de modificaciones que simplificaran la técnica de la PCR y permitieran su utilización de forma más rutinaria. Otro punto importante para la detección precoz de la enfermedad era conocer la distribución y concentración del fitoplasma en los distintos estadios fenológicos del árbol y en los distintos tejidos u órganos, con el fin de determinar el mejor momento para realizar la detección. Otra finalidad de este objetivo era determinar en que épocas del año podía propagarse la enfermedad a través de la multiplicación vegetativa, ya que se creía que el fitoplasma descendía a las raíces durante el invierno y por tanto las yemas tomadas durante este período estaban libres del mismo. También se planteó un estudio para determinar la correlación entre la detección del fitoplasma y la expresión de síntomas, ya que la detección del fitoplasma en plantas asintomáticas es esencial en los procesos de propagación vegetativa y de certificación del material vegetal obtenido.

La expresión y gravedad de los síntomas de esta enfermedad depende en gran manera de la susceptibilidad de la variedad y de la combinación porta-injertos-variedad. Se conoce que la utilización en algunos países de patrones muy sensibles como los patrones orientales, Pyrus serotinia y P. ussuriensis introducidos por su resistencia al fuego bacteriano, hicieron proliferar la enfermedad del Pear decline y causar la muerte a un gran número de árboles en décadas anteriores. Así pues, otro de los objetivos del proyecto fue el estudio en parcelas experimentales y en parcelas comerciales del desarrollo de síntomas en distintas combinaciones patrón-variedad.

 

 

2.-PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

 

Los objetivos y actividades que se propusieron en este proyecto fueron:

  

 1.-Epidemiología de la enfermedad causada por Pear decline (PD)

1.1.-Prospección para determinar la presencia e incidencia del PD en Cataluña

       Actividad 1.- Observación de 1500 parcelas comerciales y valoración de la incidencia de la enfermedad  en 45 parcelas afectadas mediante observación de 500 árboles en cada una de ellas.

1.2.-Epidemiología de la enfermedad del PD en Cataluña. Seguimiento del índice de plantas enfermas en distintas parcelas afectadas. Identificación de vectores potenciales.

       Actividad 2.- Seguimiento de la incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas durante 4 años.

       Actividad 3.- Identificación de vectores potenciales mediante captura de insectos en tres parcelas afectadas y análisis de la presencia del fitoplasma en las especies potencialmente transmisoras de fitoplasmas.

 

2.- Etiología de distintas sintomatologías observadas en plantaciones de peral en el Noreste de España. Identificación de virus, fitoplasmas e identificación del fitoplasma asociado al Pear decline (PD).

La finalidad de este objetivo era determinar si la distinta gravedad y expresión de síntomas observada podía ser debida a la presencia de otros agentes infecciosos (virus u otros fitoplasmas). Para ello se realizaron dos actividades:

            Actividad 4.- Análisis serológico para determinar la presencia de Apple stem grooving virus (ApSGV) y Apple chlorotic leaf spot virus (ApCLSV) y análisis mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas en 250 muestras de árboles presentando síntomas de decaimiento.    

            Actividad 5.- Análisis para determinar la presencia de distintos virus i/o fitoplasmas mediante indexaje en huéspedes sensibles de 30 muestras presentando distintos síntomas de decaimiento. 

 

3.- Detección y caracterización molecular de la enfermedad.

      3.1.- Actividad 6. Mejora de las técnicas de detección por PCR. Valoración de la sensibilidad de distintos pares de iniciadores universales y específicos (P1/P7, fU5/rU3, fO1/rO1, fPD/rPD, P1/PYLR, R16(X). Metodología de la extracción del ADN . Lectura de resultados de la amplificación por PCR.

    3.3.- Actividad 7. Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma asociado al Pear decline .

La finalidad de esta actividad era conocer si la distinta gravedad de síntomas de decaimiento podía ser debida a la presencia de distintos aislados de este fitoplasma.        

3.3.1.-Puesta a punto de la técnica de la SSCP para la diferenciación de aislados de fitoplasmas.

            3.3.2.- Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma mediante RFLP con diferentes enzimas de restricción.

 

4.- Evaluación de material vegetal. Estudio de las relaciones huésped-patógeno. Distribución del patógeno en el árbol. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas de la enfermedad del Pear Decline (PD).

    4.1.-Distribución del patógeno en el árbol.

La finalidad de este objetivo fue determinar la distribución del fitoplasma en el árbol para determinar el mejor momento para realizar la detección y para conocer la posible transmisión del fitoplasma mediante propagación vegetativa en cada época.

           Actividad 8.- Identificación del patógeno en diferentes niveles del árbol en las variedades Limonera y  Decana del congreso.

           Actividad 9.- Seguimiento de la detección a lo largo del año (junio-mayo) en 45 árboles pertenecientes a las variedades Blanquilla, Limonera y Barlett. 

    4.2.-Evaluación de la susceptibilidad y resistencia del material vegetal. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo de los síntomas.

            Actividad 10.- Seguimiento de la expresión de síntomas a lo largo del año en árboles afectados de las variedades Blanquilla injertada en peral franco, Blanquilla injertada en membrillero, Limonera injertada en peral franco y Barlett injertada en peral franco.  

           Actividad 11.- Ensayo realizado con cinco patrones ( C.oblonga BA-29, C.oblonga MA, C. oblonga Adams, Pyrus communis y P. communis OHF-333) y cuatro variedades (Blanquilla, Conference, Mantecosa Bosc y Decana del congreso).

 

3.-GRADO DE CONSECUCIÓN DE LOS OBJETIVOS

 

Objetivo 1.-Epidemiología de la enfermedad causada por Pear decline

            1.1.- Prospección para determinar la importancia de la enfermedad causada por el fitoplasma asociado al Pear decline

            Se realizó la prospección tal como estaba prevista en el proyecto, lo que nos permitió conocer la incidencia de la enfermedad del decaimiento del peral o Pear decline en Cataluña y su distribución por variedades y patrones.

            1.2.- Seguimiento del índice de plantas enfermas en distintas parcelas afectadas. Identificación de vectores potenciales.

            Se valoró el incremento de la incidencia de la enfermedad durante cuatro años (1997-2000).

            Se realizó durante dos años (1998-1999) un seguimiento de la población de especies potencialmente transmisoras de fitoplasmas en tres parcelas afectadas por Pear decline. Individuos de estas especies capturados desde abril hasta octubre fueron analizados mediante PCR para determinar la presencia del fitoplasma en ellos.

            Se identificó Cacopsylla pyri como única especie portadora del fitoplasma asociado al Pear decline en la zona.

 

Objetivo 2.-Etiología de distintas sintomatologías observadas en plantaciones de peral en el Noreste de España. Identificación de virus y fitoplasmas en muestras con síntomas.

            Este objetivo se desarrolló tal como estaba previsto en el proyecto, por un lado 250 muestras con síntomas de decaimiento procedentes de 10 parcelas afectadas fueron analizadas serológicamente para determinar la presencia de ApSGV  y ApCLSV. Estas mismas muestras fueron analizadas mediante PCR con iniciadores universales y específicos para determinar la presencia de fitoplasmas. Por otro lado 3 muestras con síntomas de decaimiento de cada una de las 10 parcelas fueron injertadas sobre huéspedes sensibles para determinar la presencia de otros virus y enfermedades transmisibles del peral.

            El fitoplasma asociado al Pear decline fue identificado como el principal patógeno responsable de la sintomatología de decaimiento ya que solamente en un pequeño porcentaje de las muestras analizadas se detectó alguna de las virosis analizadas. El único fitoplasma identificado en las muestras analizadas fue el asociado al Pear decline perteneciente al grupo Apple proliferation. No se identificaron fitoplasmas pertenecientes a otros grupos.

 

Objetivo 3.-Detección y caracterización molecular de la enfermedad

            3.1.- Valoración de la sensibilidad de distintos pares de iniciadores universales y específicos. Mejora de las técnicas de detección del fitoplasma asociado al PD.

            Se ensayaron distintos iniciadores universales y específicos, determinándose los que daban mejores resultados para la detección de este fitoplasma.

            Debido a que el fitoplasma asociado al Pear decline es uno de los que se encuentra en concentraciones más bajas en el árbol resulta difícil la simplificación de la técnica de extracción de su ADN, sin embargo se  mejoró la extracción utilizando volúmenes pequeños de extracto, lo que permitió procesar un mayor número de muestras que utilizando el volumen recomendado habitualmente. Se puso a punto la técnica de la inmunocaptura para la detección de fitoplasmas. No se obtuvieron buenos resultados para la detección de Pear decline, posiblemente debido a la baja concentración con que se encuentra en el árbol. Sin embargo, si se obtuvieron buenos resultados en la detección de otros fitoplasmas como el stolbur en Catharantus roseus, por lo que debido al interés de esta técnica se sigue trabajando en ella para la detección del PD.

            Se  puso a punto un método de lectura de resultados de la PCR alternativo a la electroforesis.

           

            3.2.- Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma asociado al PD 

            Se analizaron mediante RFLP, muestras de distintos orígenes geográficos (España, Alemania) positivas para Pear decline. Los análisis de variabilidad se realizaron exclusivamente con el fragmento de ADN perteneciente al gen ribosómico 16S muy conservado en todos los fitoplasmas y hasta el momento no se han determinado diferencias en estos fragmentos.

             Se puso a punto la técnica del análisis del polimorfismo conformacional del ADN monocatenario (SSCP) para la diferenciación de aislados de fitoplasmas. Esta técnica había sido utilizada con éxito para la diferenciación de aislados de distintos virus pero no había sido aplicada a la diferenciación de aislados de fitoplasmas.

 

Objetivo 4.- Evaluación de material vegetal. Estudio de las relaciones huésped-patógeno. Distribución del patógeno en el árbol. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas de la enfermedad del Pear Decline (PD).

 

4.1.-Distribución del patógeno en el árbol.

            Se determinó la distribución y presencia del fitoplasma en al árbol a lo largo del año. Se determinó el mejor momento para la realización del diagnostico y el mejor órgano o tejido para realizar el análisis. Se identificó el fitoplasma durante el invierno, lo que puso de manifiesto el peligro de propagar la enfermedad durante este período.

 

            4.2.-Evaluación de la susceptibilidad y resistencia del material vegetal. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo de los síntomas.

            Se determinó la evolución de la sintomatología en parcelas comerciales a lo largo del año en las distintas variedades y en las distintas combinaciones patrón-variedad. Se determinó que los síntomas son más severos en las variedades injertadas sobre membrillero que sobre peral franco.

            Los ensayos en parcelas experimentales no se pudieron iniciar el primer año de proyecto como estaba previsto y distintos factores han hecho que no se haya dispuesto del ensayo completo hasta el tercer año de proyecto. Actualmente se dispone del ensayo tal como estaba previsto pero no se dispone todavía de resultados de esta actividad.

 

4.-CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS

 

Objetivo 1.-Epidemiología de la enfermedad causada por Pear decline

            Actividad 1.- Valoración de la importancia del decaimiento del peral en las áreas productivas de nuestro país.

Uno de los objetivos de este proyecto fue la realización de una prospección en las áreas productivas de peral de Cataluña y Aragón con el fin de conocer la importancia de la enfermedad en nuestro país. La prospección en Cataluña se realizó con la colaboración de los técnicos de las Asociaciones de Defensa Vegetal y consistió en la observación de más de 1500 parcelas comerciales. Los resultados de esta prospección mostraron que alrededor del 7 % de las parcelas observadas presentaban una incidencia de plantas enfermas superior al 5 % y que probablemente existan más parcelas afectadas con una incidencia menor (Tabla 1). La variedad más afectada fue la Limonera con un 15% de las parcelas de esta variedad afectadas y la menos la variedad Blanquilla con un 1% de parcelas afectadas. Otras variedades afectadas fueron  Barlett y Williams (7% de parcelas afectadas), Conference, Ercolini y Abatte Fettel (Tabla 1). En las distintas parcelas donde se presentaban síntomas de decaimiento se tomaron muestras de árboles afectados y se analizaron por PCR-nido con iniciadores universales y específicos para confirmar o descartar si la sintomatología era debida al fitoplasma. En las parcelas donde se confirmó la presencia del fitoplasma se determinó la incidencia de la enfermedad mediante observación visual de 250 a 500 árboles, dependiendo del tamaño de la parcela. Los resultados obtenidos mostraron que esta oscilaba de un 5 a un 60% de árboles enfermos (Tabla 2). La incidencia mayor se presentaba en parcelas de la variedad Limonera injertada tanto en C. oblonga (32-59% de incidencia) como en P.communis (8-58%) (Tabla 2).

 

Tabla 1.- Variedades de peral afectadas por Pear decline (PD) y porcentaje de parcelas afectadas de cada una de ellas en Cataluña

 

Variedad

Área Cultivada (Ha)

Número de parcelas muestreadas1

Número de parcelas afectadas

% parcelas afectadas por PD

Limonera

2350

305

48

15,73%

Conference

1608

209

12

5,78%

Ercolini

644

83

2

2,40%

Blanquilla

3247

422

4

  0,94 %

Otras2

3696

481

35

7,27%

Total

11.545Ha

  1500

  101

 6,73%

1Las parcelas muestreadas tenían una superficie aproximada de 1 Ha

2Williams, Barlett, Devoe, Alejandrina y Moratini   

 

Tabla 2.-Incidencia de árboles con síntomas de decaimiento en 45 parcelas afectadas y porcentaje de detección del fitoplasma por  PCR-nido con los iniciadores P1/P7 y rO1/fO1.

 

Variedad

Patrón

Número de parcelas

Porcentaje  de árboles con síntomas (%)1

% de muestras positivas por PCR/ total árboles con síntomas

Limonera

C.oblonga

16

32-59%

60%

Limonera

P.communis

12

8-58%

67%

Barlett

C.oblonga

2

12-22%

60%

Barlett

P.communis

5

20-32%

75%

Williams

C.oblonga

2

14-22%

60%

Williams

P.communis

4

23-29%

65%

Blanquilla

C.oblonga BA29

4

5-35%

50%

1 Valorado en las parcelas donde se muestrearon los árboles con síntomas

 

La consecución de este objetivo nos ha permitido conocer que la enfermedad esta ampliamente distribuida tanto en la variedad Limonera, una de las más cultivadas en la región y de la cual se están realizando nuevas plantaciones, como en otras variedades. Por otro lado el fitoplasma también se identificó en plantones certificados procedentes de vivero, lo que indica que los controles realizados no son suficientes para garantizar la sanidad del material vegetal.

 

1.2.-Epidemiología de la enfermedad del PD en Cataluña. Seguimiento del índice de plantas enfermas en distintas parcelas afectadas. Identificación de vectores potenciales.

 

       Actividad 2.- Seguimiento de la incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas durante 4 años.

Se realizó un estudio epidemiológico en el que se valoró el incremento de la incidencia de la enfermedad en 7 parcelas afectadas y en el que se realizó un seguimiento de las especies de insectos potencialmente vectores de fitoplasmas.

El incremento de la enfermedad en estas parcelas dependió de la variedad y de la incidencia inicial oscilando de un 13% a un 35% de incremento para los cuatro años. El mayor incremento se produjo en las parcelas 2 y 3 correspondientes a la variedad Limonera injertada sobre C. oblonga (BA-29 y MA respectivamente) de entre 8 y 11 años de edad (Tablas 3 y 4). 

 

Tabla 3.- Características de las parcelas en las que se evaluó la evolución de la incidencia de árboles enfermos (1-7) y  realizado la captura de insectos (1, 2 y 7).

 

Parcela

Variedad

Porta injerto

Edad (años)

Sistema de riego

1

LIMONERA

Peral franqueado

Arrancada

Localizado goteo

2

LIMONERA

BA29/ intermediario

8-9

Localizado goteo

3

LIMONERA

Membrillero MA

11

A manta

4

WILLIAMS

Membrillero

25

A manta

5

BARLETT

Peral franqueado

14

Localizado goteo

6

BLANQUILLA

BA-29/ intermediario

9

Localizado goteo

7

LIMONERA

Peral franqueado

>20

A manta

 

 

 

  Tabla 4.- Incidencia de árboles con síntomas en 7 parcelas afectadas y porcentaje de detección del fitoplasma en las muestras con síntomas

 

 

VARIEDAD

INCIDENCIA

%Plantas síntomas/1997

INCIDENCIA

%Plantas

síntomas /1998

INCIDENCIA

%Plantas

síntomas /1999

INCIDENCIA

%Plantas

síntomas /2000

Incremento

1997-2000

1

LIMONERA

9,30%

-

-

-

-

2

LIMONERA

12.47%

21,00%

35%

38%

26%

3

LIMONERA

22.96%

26,00%

29,50%

58%

35%

4

WILLIAMS

8.33%

18,00%

22,00%

25%

16%

5

BARLETT

18.18%

25,45%

30,73%

32%

13%

6

BLANQUILLA

21.00%

27,00%

33,00%

35%

14%

7

LIMONERA

-

37,00%

42,00%

50%

13%

 

 

 

       Actividad 3.- Identificación de vectores potenciales mediante captura de insectos en tres parcelas afectadas y análisis  de la presencia del fitoplasma en las especies potencialmente transmisoras de fitoplasmas.

 

Para establecer los insectos portadores del fitoplasma del PD se procedió a su captura mediante trampas amarillas adhesivas situadas  a 0,5 m y a 2,5 m en tres de las parcelas en las que se realizó el seguimiento de árboles enfermos (Figura 1). Se utilizaron un total de 8 trampas por parcela, las cuales se remplazaron cada quince días y los insectos, una vez clasificados, se analizaron mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas en ellos. Se analizaron las especies pertenecientes a grupos potencialmente vectores de fitoplasmas (cicadélidos, fulgóridos y psílidos). Las claves utilizadas para la identificación fueron las de H. Ribaut (1952) y I. D Hodkinson & I. M. White (1979), basadas en las diferencias morfológicas principalmente de la armadura genital de los machos. La identificación de algunos insectos sólo se realizó a nivel de género, por haberse capturado únicamente hembras.

En cuanto a especies portadoras de fitoplasmas se identificaron los cicadelidos: Neoaliturus fenestratus, Psammottetix striatus y Macrosteles sexnotatus, el fulgorido Laodelphax striatellus y el psyllido Cacopsylla pyri, pero únicamente este ultimo fue identificado como portador del fitoplasma asociado al Pear decline. En las parcelas afectadas se identificaron 5 especies más del genero Cacopsylla: C.mali, C. melanoneura, C.pulchella, C.pyrisuga y C.saliceti, pero en muy bajo número y no identificándose ninguna positiva hasta el momento (Tabla 5; Figura1).

       Los estudios epidemiológicos indicaron que al igual que ocurre en otros países del área mediterránea como Italia, probablemente C.pyri es el vector más importante en la zona, ya que es la especie más abundante en la región, habiéndose capturado muy pocos o ningún individuo de las otras dos especies citadas como vectores de la enfermedad, C.pyricola y C. pyrisuga. El seguimiento de las poblaciones de esta especie y el análisis de los individuos recolectados han señalado que los primeros individuos infectados se presentan ya en mayo y que se presentan varios picos de población siendo los más importantes en junio y septiembre. 

 

 

Tabla 5.- Detección de fitoplasmas en las especies de insectos capturados en

tres parcelas de peral en Lérida

 

 

ESPECIE
Parcela

1
Parcela

2

Parcela

3

Detección

Fitoplasmas

Detección

Pear decline

 

 

 

 

 

 

Cicadellidae

 

 

 

 

 

Aphrodes carinatus

 

X

 

-

-

Balclutha rosea

X

 

 

-

-

Edwardsiana rosae

 

X

X

-

-

Empoasca decedens

 

X

 

-

-

Empoasca decipiens

X

X

X

-

-

Erythoroneura bisignata

X

 

X

-

-

Erythroneura tamaricis

X

 

X

-

-

Euscelidius variegatus

X

X

 

-

-

Hardya tenuis

X

 

X

-

-

Hauptidia marocanna

 

X

 

-

-

Hecalus storai

 

X

X

-

-

Macrosteles sexnotatus

X

X

X

+

-

Neoaliturus fenestratus

 

X

X

+

-

Neoaliturus haematoceps

X

X

X

-

-

Opsius stactogalus

X

 

X

-

-

Platymetopius sp.

X

 

 

-

-

Psammotettix striatus

X

X

 

+

-

Typhlocyba aurovitata

X

 

 

-

-

Zyginidia scutellaris

X

X

X

-

-

Delphacidae

 

 

 

 

 

Laodelphax straitells

 

X

X

+

-

Psylloidea

 

 

 

 

 

Cacopsylla pyri

X

X

X

+

+

C. mali

 

 

X

-

-

C. melanoneura

 

 

X

-

-

C. pulchella

 

 

X

-

-

C. pyrisuga

 

 

X

-

-

 

 

 

 

Objetivo 2.-Etiología de distintas sintomatologías observadas en plantaciones de peral en el Noreste de España. Identificación de virus y fitoplasmas en muestras con síntomas.

Actividad 4.- Análisis serológico para determinar la presencia de Apple stem grooving virus (ApSGV) y Apple chlorotic leaf spot virus (ApCLSV) y análisis mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas en  250 muestras de árboles con síntomas de decaimiento.    

            Otro de los objetivos del proyecto fue determinar la etiología de la enfermedad y determinar si la distinta expresión de síntomas (Figura 2)  podía estar condicionada por la presencia de distintos virus y de otros fitoplasmas distintos al PD. Para ello, se escogieron 10 parcelas que presentaban síntomas de decaimiento, reducción de crecimiento vegetativo, clorosis, necrosis, enrrollamiento y enrojecimiento de hojas. De cada parcela se tomaron muestras de 25 árboles, las cuales fueron analizadas mediante PCR para determinar la presencia de fitoplasmas. Estas mismas muestras, 250 en total fueron analizadas mediante ELISA para determinar la presencia de ApSGV y ApCLSV. Ninguna muestra resultó positiva para estas virosis el primero año, mientras que el segundo año se obtuvo una muestra positiva de ApCLSV y una de ApSGV.

El fitoplasma detectado en todas las muestras fue siempre el asociado al Pear decline perteneciente al grupo Apple proliferation.

 

Actividad 5.- Análisis para determinar la presencia de distintos virus i/o fitoplasmas mediante indexaje en huéspedes sensibles de 30 muestras presentando distintos síntomas de decaimiento

 

            Treinta muestras procedentes de las 10 parcelas citadas anteriormente ( 3 por parcela) fueron también analizadas mediante injerto sobre indicadores leñosos para poner de manifiesto otras virosis u otras sintomatologías de etiología desconocida transmisibles por injerto. Para ello se estableció una parcela de indexaje en una finca de Gimenells (Lérida). Los indicadores utilizados fueron Pyronia veitchii, Decana del congreso y Virginia Crab. Para cada muestra e indicador se injertaron cinco árboles y se dejó uno como control negativo. Para cada indicador se dispuso un bloque como control positivo compuesto por cinco árboles injertados con una muestra positiva.

            Los resultados obtenidos mostraron que únicamente un pequeño porcentaje de las muestras analizadas presentaba alguna virosis (Figura 3) y que por tanto el principal responsable de la sintomatología parece ser el fitoplasma, ya que éste se detectó mediante PCR en las muestras sintomáticas en unos porcentajes que oscilaron entre un 60 y un 80%. La mayor o menor expresión de síntomas parece depender más de las condiciones climáticas, los años de mayor sequía se observó un mayor porcentaje de árboles con síntomas y de la variedad o patrón utilizado ya que los síntomas fueron más patentes en las variedades injertadas sobre membrillero que sobre peral franco, tal como se ve en los resultados del objetivo 4.

 

 

 

3.- Detección y caracterización molecular de la enfermedad.

 

Actividad 6.- 3.1- Mejora de las técnicas de detección por PCR. Valoración de la sensibilidad de distintos pares de iniciadores universales y específicos (P1/P7, fU5/rU3, fO1/rO1, FPD/rPD, P1/PYLR, R16(X). Metodología de la extracción del ADN . Lectura de resultados de la amplificación por PCR.

   

            La técnica de diagnóstico empleada en todos los estudios realizados fue la PCR, evaluándose la sensibilidad de distintos métodos de extracción del ADN y también la sensibilidad de distintos iniciadores universales y específicos. Para la extracción de ADN se determinó que el mayor rendimiento se obtenía cuando se realizaba una primera fase de concentración de fitoplasmas y que la mayor concentración de ADN se obtenía cuando la extracción se realizaba a partir de la corteza o de yemas. Para la realización de la PCR se observó que era necesario la realización de la PCR nido, ya que una única PCR era insuficiente para la detección de este fitoplasma. Los iniciadores que mejores resultados dieron fueron P1/P7, seguidos de fU5/rU3 como universales o de fO1/rO1 como específicos (Tabla 6).

     Estos últimos iniciadores son específicos para todos los fitoplasmas del grupo Apple proliferation y detectaron un mayor número de muestras positivas que el par especifico para PD (fPD7/rPD). Otros pares ensayados como los del grupo (R16) desarrollados por Lee et al. 1995, dieron peores resultados, principalmente de especificidad.

Se realizaron ensayos de inmunocaptura para la realización de la PCR, utilizando para ello extractos brutos del material vegetal, pero hasta el momento no se han obtenido buenos resultados para la detección del PD, probablemente debido a la poca concentración con que se encuentra este fitoplasma.  Si que se obtuvieron buenos resultados para la detección del fitoplasma asociado al stolbur, cuando este se encontraba en Catharantus roseus donde la concentración del fitoplasma es elevada (Figura 6). Sin embargo debido al interés que tendría el poder realizar la PCR directamente con extractos vegetales se prevé realizar más ensayos en el proyecto que se ha iniciado este año.

Se desarrolló un método para la lectura de los resultados de la PCR como alternativa a la realización de la electroforesis y a la tinción con Bromuro de etidio. El método consistió en la utilización de iniciadores marcados con biotina. El producto de la PCR (2 ml) fue depositado en membranas de nylon, hibridado con streptoavidina-fosfatasa alcalina y a continuación se reveló con nitroblue de tetrazolio.   

           

Tabla 6.- Identificación de fitoplasmas en muestras de peral con síntomas con iniciadores universales y específicos.

 

Iniciadores

% muestras + / muestras con síntomas

Nested PCR (P1/P7 y U3/U5)

67%

fO1/rO1

58%

fPD/rPD

42%

P1/PYLR

42%

 

 

Figura 6.- Detección mediante PCR en extractos vegetales fijados mediante inmunocaptura. Filas 4,5,6, 11, 12 y 13, extractos de Catharantus roseus infectada con stolbur.  Filas 14 y 15 control positivo. Filas 10 y 19, control de peso molecular. 

 

 

 

 

Actividad 7. Objetivo 3.2.- Estudio de la variabilidad genética del fitoplasma asociado al Pear decline

El conocimiento de la posible presencia de distintos aislados de este fitoplasma es muy importante para completar los estudios epidemiológicos realizados. El conocimiento de cómo evoluciona el fitoplasma y su relación con la expresión de síntomas es un parámetro a tener en cuenta para el control de la enfermedad. Sin embargo los estudios de variabilidad genética únicamente se han iniciado y deben continuarse con el estudio de otras zonas del ADN del fitoplasma.

Para la caracterización de aislados se puso a punto la técnica del análisis del polimorfismo conformacional del ADN monocatenario (SSCP). Esta técnica había sido utilizada con éxito para la caracterización de aislados del virus de la tristeza y para la caracterización de aislados de otros virus y viroides, pero no había sido utilizada para la diferenciación de aislados de fitoplasmas. 

            También se utilizó la digestión del producto de la PCR con distintas enzimas de restricción, pero hasta el momento no se han encontrado diferencias entre las muestras evaluadas hasta el momento.

            Todos los estudios realizados hasta el momento, tanto de SSCP como de RFLP  se han realizado con fragmentos de ADN pertenecientes al gen ribosómico 16S, amplificados con iniciadores específicos. Actualmente se han iniciado  estudios utilizando otras zonas del genoma del fitoplasma.

 

 

4.- Evaluación de material vegetal. Estudio de las relaciones huésped-patógeno. Distribución del patógeno en el árbol. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo y expresión de los síntomas de la enfermedad del Pear Decline (PD).

 

    4.1.-Distribución del patógeno en el árbol.

La finalidad de este objetivo fue determinar la distribución y presencia del fitoplasma en las distintas partes del árbol a lo largo del año, con el fin de determinar la época más adecuada para realizar el diagnóstico. Para la consecución de este objetivo se realizaron dos ensayos:

 

           Actividad 8.- Identificación del patógeno en diferentes niveles del árbol en las variedades Limonera y  Decana del congreso.

El objetivo de esta actividad fue determinar la presencia del fitoplasma durante el periodo invernal en los distintos niveles del árbol.

            Para este ensayo se escogieron siete árboles de la variedad Limonera y cinco de la variedad Decana del congreso identificados previamente como positivos y quincenalmente de enero a abril se tomaron y analizaron muestras de tres niveles distintos del árbol (Gráfico 1)

De forma general, no parecen existir diferencias considerables en la detección por niveles, si bien en el mes de marzo aumentó el porcentaje de detección en el nivel más bajo (Gráfico 1). Por tanto la conclusión de esta actividad es que la toma de muestras para la realización del diagnostico debe realizarse de forma aleatoria de las distintas partes del árbol.

            La localización del fitoplasma en los vasos liberianos durante el invierno también se puso de manifiesto mediante microscopia confocal (Figura 4).

 

Actividad 9.- Seguimiento de la detección a lo largo del año (junio-mayo) en 45 árboles pertenecientes a las variedades Blanquilla, Limonera y Barlett. 

 

El estudio se realizó en 45 árboles pertenecientes a tres variedades (Barlett, Limonera y Blanquilla). Los resultados obtenidos mostraron que el fitoplasma se detecta desde junio hasta abril y que al contrario de lo señalado hasta ahora por otros autores, el fitoplasma podía detectarse durante el periodo de latencia invernal. Actualmente se está estudiando si el fitoplasma detectado durante el invierno es viable. Para ello se injertaron patrones de membrillero con yemas procedentes de estaquillas con resultado positivo para PD en invierno. La persistencia durante el periodo invernal es un factor a tener en cuenta ya que la diseminación del fitoplasma a través de los injertos de invierno puede ser importante sino se realizan controles adecuados. Hasta ahora existía la creencia de que mediante el injerto de yemas tomadas en invierno se evitaba la diseminación de la enfermedad. La detección durante el periodo invernal se realizó en las variedades Limonera, Barlett, Blanquilla, Decana de comice, Abatte Fettel y Flor de invierno.

Para la mayoría de variedades el porcentaje de identificación más alto se produjo durante el mes de diciembre, con un 100, 100 y 53 % de detección para las variedades Limonera, Barlett y Blanquilla respectivamente (Gráfico 2). Para la variedad Limonera la detección también fue del 100% los meses de Enero y Febrero, mientras que en la variedad Blanquilla la detección fue en general baja siendo los meses con mayor porcentaje de detección julio y diciembre (Gráfico 2).

En cuanto a la parte estructural del árbol, donde mejor se detecta el fitoplasma es en la corteza, seguido de las yemas.  En los nervios de las hojas es donde menos se detecta al contrario de lo que ocurre en otras especies vegetales como viña (Gráfico 3).

 

 

 

    4.2.-Evaluación de la susceptibilidad y resistencia del material vegetal. Influencia de la combinación patrón-variedad en el desarrollo de los síntomas.

            Actividad 10.- Seguimiento de la expresión de síntomas a lo largo del año en árboles afectados de las variedades Blanquilla injertada en peral franco, Blanquilla injertada en membrillero, Limonera injertada en peral franco y Barlett injertada en peral franco.  

            Esté ensayo se realizó con los mismos 45 árboles utilizados en la actividad anterior y consistió en anotar mensualmente los síntomas observados en los quince árboles de cada variedad.

            La sintomatología asociada al PD era patente ya en el mes de mayo en un 46, 40 y 60% de los árboles observados de las variedades Barlett, Limonera y Blanquilla respectivamente, aunque fue en noviembre cuando estos fueron más acusados, con el 100% de los árboles presentando síntomas (Gráfico 4).  Los síntomas varían según el tipo de variedad, así en Barlett los síntomas más característicos fueron clorosis, manchas necróticas y enrojecimiento prematuro; en Limonera clorosis, manchas necróticas y disminución del crecimiento y por ultimo en Blanquilla, clorosis y disminución del crecimiento en los meses de mayo y septiembre.  

 

           Actividad 11.- Ensayo realizado con cinco patrones ( C.oblonga BA-29, C.oblonga MA, C. oblonga Adams, Pyrus communis y P. communis  OHF-333) y cuatro variedades (Blanquilla, Conference, Mantecosa Bosc y Decana del congreso).

Los ensayos se encuentran en curso y consisten en valorar la susceptibilidad a la infección de cinco patrones injertados con cuatro variedades (20 combinaciones). Este ensayo se inicio hace un año y se requieren dos años más de observaciones para disponer de resultados concluyentes.

El conocimiento de estos resultados es muy importante para decidir los patrones y variedades más adecuados a utilizar en una zona donde la enfermedad y el vector están presentes y por tanto es muy difícil su erradicación. La utilización del material vegetal más tolerante a la enfermedad junto con un control adecuado del vector y un control sanitario riguroso del material de nueva plantación, son por ahora los únicos métodos para que los daños producidos por la enfermedad sean pocos.

 

 

 

 

 

5.- APLICACIÓN AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSIÓN DE RESULTADOS

 

            La prospección realizada para conocer la incidencia real del fitoplama asociado al decaimiento del peral ha permitido conocer la importancia de la enfermedad y su participación en una sintomatología que muchas veces se atribuía erróneamente a otras causas. El conocimiento de la distinta expresión de síntomas de esta enfermedad ha permitido que los técnicos  puedan identificar la enfermedad en las distintas épocas del año y en las distintas variedades y patrones.

            La identificación del fitoplasma durante el invierno ha mostrado el peligro de propagar la enfermedad a través de yemas tomadas durante este período. 

            Los estudios de detección a lo largo del año y en distintos tejidos y órganos han mostrado cual era el mejor momento para identificar la enfermedad con la máxima fiabilidad y como y de donde se debían tomar las muestras. Estos datos han sido difundidos entre técnicos y productores que envían muestras a distintos laboratorios para ser analizadas.

            Se ha confirmado que la observación visual de síntomas es insuficiente para el control del material vegetal en viveros, ya que el fitoplasma esta presente mucho antes de la aparición de síntomas.

            Se ha confirmado que Cacopsylla pyri era el principal vector de la enfermedad en nuestro país y se ha determinado el porcentaje de individuos infectados de esta especie a lo largo del año en tres parcelas afectadas. 

            Se han determinado las mejores condiciones para el análisis del PD mediante PCR, evaluando iniciadores, métodos de extracción de ADN y modalidades de lectura de resultados.

            Los resultados obtenidos han sido difundidos mediante publicaciones científicas y de divulgación. Algunas publicaciones se encuentran todavía en preparación como las concernientes a la evolución y distribución del fitoplasma en el árbol, cuantificación del fitoplasma en las distintas partes del mismo, mejora de técnicas de diagnostico, valoración de la susceptibilidad al fitoplasma de distintas combinaciones patrón-variedad, etc.

            También se han mantenido reuniones anuales con los técnicos de las Asociaciones para Defensa de los vegetales y con el sector.

            Así mismo se han mantenido informados de los resultados a todas las entidades y empresas que han colaborado en el proyecto. 

 

 

6.- COLABORACIONES Y AYUDAS PRESTADAS

 

Se ha contado con la colaboración de los técnicos de las Asociaciones de Defensa Vegetal de Lérida y Gerona, los cuales han participado activamente en la realización de las prospecciones, localizando las parcelas afectadas y realizando la toma de muestras en algunos casos.

También se ha contado con la ayuda de distintas empresas como CERTIPLANT, INVITRO SA Y AGROMILLORA CATALANA SA,  las cuales han suministrado el material vegetal para los ensayos de susceptibilidad o resistencia al Pear decline.     

Se contó con una beca predoctoral de la CIRIT (Comisió Interdepartamental de Recerca i Tecnología) con la cual se incorporó al proyecto un becario, Meritxell García Chapa,  para realizar su tesis doctoral en uno de los objetivos del proyecto (Mejora de técnicas de diagnostico y variabilidad genética del fitoplasma). Este becario se incorporó el último año de proyecto y sigue su tesis en el proyecto que se ha iniciado este año.

 

7.- VINCULACIÓN DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACIÓN CIENTÍFICA TÉCNICA INTERNACIONAL: ENTIDADES EXTRANJERAS CON LAS QUE SE HA COOPERADO, FINANCIACIÓN Y CUANTIA EN SU CASO Y UTILIZACIÓN DE LOS RESULTADOS ALCANZADOS.

 

            Se ha tenido una cooperación bilateral con Alemania para el estudio de especies de insectos transmisores del fitoplasma del stolbur. Esta cooperación nos permitió incorporar una visita al Institut fuer Pflanzenschutz im Obstbau de Dossenheim (Alemania) e iniciar una colaboración con el Dr. Seemüller de este Instituto. Esta colaboración consistirá principalmente en la caracterización molecular de aislados de Pear decline procedentes de Alemania y España.

            El coordinador del proyecto tuvo una beca CIRIT en 1997 de un mes de duración para una estancia con el grupo de fitoplasmas dirigido por el Dr. Bruce Kirkpatrick de la Universidad de Davis (California). 

            Durante el proyecto hemos asistido a dos reuniones del grupo de investigadores que trabajan en fitoplasmas La primera fue en 1998 y tuvo lugar en Sydney, el tema de trabajo de esta reunión fue acordar puntos para establecer unas claves adecuadas para la taxonomía de los fitoplasmas. La segunda fue convocada por el Dr. Bové y tuvo lugar en diciembre de 1999 en el INRA de Burdeos, la finalidad de la misma era preparar dos proyectos para ser presentados a la CEE, uno de caracterización molecular de fitoplasmas y otro de epidemiología de fitoplasmas.

            A través de un acuerdo de cooperación Ibero Americana de la Universidad de Lérida se tuvo un becario (Omar Giovanni Rodríguez) que realizó su proyecto final de carrera, llevando a cabo uno de los objetivos del proyecto (Detección del fitoplasma del Pear decline en distintos niveles del árbol).