2026-04-13T04:07:54Zhttps://recercat.cat/oai/request

oai:recercat.cat:10459.1/636102024-12-05T21:28:45Zcom_2072_3622col_2072_479130

2024-12-05T21:28:45Z urn:hdl:10459.1/63610 TrkA COOH-terminal tail: its relevance on receptor stability and signaling for cell differentiation and survival Maya Vladkova, Georgieva ubiniquization Nedd 4-2 ubligasa Trka neurotrophin receptor degradation Bioquímica i Biologia molecular 577 El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a la diferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització i molècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan ben estudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA han estat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilació del receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació i supervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augment transitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora de Ca2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estava interessat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interacciona directament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partir d'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió a calmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar una seqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en el extrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicions conservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 i Val790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A i TrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió a CaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importants per a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una forta interacció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentada co-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüència s'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada per Nedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat de receptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Tot plegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reducció en la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaços d'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió de neurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició de l'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2. Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràfic endosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera la degradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkA no interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització del receptor conduent a la diferenciació cel·lular. El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia y diferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de las principales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión del ligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas que interaccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación del receptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para la diferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, también conlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensora de calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo tenía interés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de forma directa y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir de estos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulina dentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraron ninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, nos centramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posiciones conservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaM cambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron que los mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto no formaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado que estos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminal con Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dos proteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensa multimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estos resultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa de un direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en un incremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidad de receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías de señalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparando con el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminal de TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, la ubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptores mutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación del receptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere con la activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptor que conduce a la diferenciación celular. The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival and differentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathways and adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied, recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novel mechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionally to activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such as MAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calcium concentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkA signaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM and TrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in a Ca2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of the calmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software was unable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focused on the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conserved positions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching them to Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/ V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved on CaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids are important for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed a stronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroborated with a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently, we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors by Nedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a faster late endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutant receptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by the C-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and were even more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Our results demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2 binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkA endosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. In addition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation of signaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading to differentiation. 2024-12-05T21:28:45Z 2024-12-05T21:28:45Z 2011-04-12T17:46:17Z 2010-12-02 2010-09-17 2010-12-02 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://hdl.handle.net/10459.1/63610 ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. info:eu-repo/semantics/openAccess Universitat de Lleida TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)