Aunque la fisiopatología de la depresión aún no está completamente clara, se sabe que implica perturbaciones en la transmisión monoaminérgica en el cerebro. Los actuales fármacos antidepresivos limitan su eficacia terapéutica a una serie de pacientes, y están ligados a efectos secundarios serios. Con miras a ampliar los agentes terapéuticos, los estudios recientes sugieren que la existencia de dimerización entre los receptores de galanina (GalR1) y serotonina (5HT-1A), pueden ser relevantes en los trastornos del estado de ánimo. A nivel fisiológico la galanina es coexpresada con la serotonina, participando en sus procesos de modulación, mediante receptores acoplados a proteínas G entre los cuales se destaca el receptor GalR1 y sus rutas de señalización intracelular (Gi/0). En este trabajo se han co-expresado el GalR1 y el 5HT-1A en células HEK 293T para evaluar su posible interacción mediante la técnica de FRET. Los resultados obtenidos confirman la heterodimerización entre los dos receptores, presentando eficiencias de FRET de alrededor del 48,5% cuando las células fueron transfectadas con 1μg de 5HT-1A-pCFP y variando la cantidad de GalR1-pYFP (0,5μg-4μg). Así mismo se observó una disminución en la eficiencia (≈42%) al someter a las células co-transfectadas a concentraciones de 200μM, 300μM y 400μM de ZnCl2. Debido a su gran importancia como diana terapéutica, se purificó el receptor GalR1 mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando los detergentes DM, CHAPS y OGP como eluyentes y su estado conformacional fue evaluado usando espectroscopia de fluorescencia (fluorescencia intrínseca del triptófano). A pesar de la presencia del receptor y la evidencia de un red-shift en todas las muestras, la proteína purificada con DM mostró un desplazamiento más lento y gradual en la λMAX de emisión (1nm-2nm) tras la adición de DTT (200μM-1500μM) y urea (8mM) que los otros detergentes, sugiriendo que el DM proporciona un ambiente más flexible y por ende una mayor estabilidad al receptor. Por otra parte, mediante la sobre-expresión en E. coli de la proteína quimera transducina (Gαt/i1) como modelo, se establecieron las condiciones de inducción óptimas (IPTG 30μM, 16h at 23ºC) y se continuó con su exitoso aislamiento y purificación mediante cromatografía de afinidad (prodominio de subtilisina) con el objetivo principal de utilizar estas técnicas como métodos estandarizados y poder expresar, aislar y purificar la subunidad α de la proteína Gi1 mediante la clonación su gen en el vector PG58-prodominio para llevar a cabo, en futuras investigaciones, ensayos funcionales (galanina-GALR1-Gi). |