Abstract:
|
Les proteïnes HMGA humanes són proteïnes nuclears d’alta mobilitat electroforètica que poden
modificar la conformació espacial del DNA, regulant l’expressió de nombrosos gens. Se sap que
la interacció es dóna a través d’uns motius d’unió al DNA anomenats AT-hooks, que s’uneixen a
regions riques en ATs del DNA. D’aquesta manera les HMGAs influeixen en molts processos
cel·lulars normals com són el creixement, la diferenciació cel·lular o la reparació del DNA.
D’altra banda, les proteïnes HMGA estan relacionades amb nombrosos processos patològics,
entre ells el càncer.
Per a comprendre el mecanisme d’acció d'aquestes proteïnes cal determinar l’estructura
tridimensional dels complexos d’aquestes amb el DNA. Amb aquesta finalitat en aquest treball
es persegueix l’obtenció de co-cristalls de la proteïna HMGA1a i els seus fragments amb
oligonucleòtids sintètics rics en seqüències ATs. Igual d’important és la cristal·lització d’aquests
mateixos oligonucleòtids amb pèptids corresponents a les regions AT-hook, ja que al ser
seqüències molt més curtes podrien ser més fàcilment cristal·litzables i ens aportarien també
informació de com interaccionen específicament amb zones riques en ATs.
En primer lloc, s’ha obtingut la proteïna HMGA1a humana (i els seus fragments) a partir de la
seva expressió en un cultiu bacterià d’Escherichia coli utilitzant la tecnologia del DNA
recombinant. Posteriorment s’ha purificat aquesta proteïna fins al grau adient pels experiments
de cristal·lografia. Aquesta purificació s’ha realitzat mitjançant la cromatografia de bescanvi
catiònic. D’altra banda, s’ha obtingut un nou mutant de la proteïna HMGA1b, l’HMGA1b(1-90),
mitjançant la tècnica de la mutagènesi dirigida per a futurs assajos de cristal·lització.
En una segona etapa, s’han dut a terme diferents assajos cristal·logràfics fent servir la tècnica de
difusió de vapor amb gota penjada, tant del complex DNA-HMGA1a com dels complexos
DNA-pèptid. S’han realitzat un centenar de proves cristal·logràfiques i s’han congelat un total de
31 cristalls. Alguns d’aquests cristalls s’han difractat a les instal·lacions de la Plataforma
Cristal·logràfica del Parc Científic de Barcelona.
Finalment hem proposat un model estructural per a un complex oligonucleòtid-pèptid congelat
en estudis anteriors. A partir dels diagrames de difracció d’aquest cristall hem trobat els
paràmetres de cel·la, el grup espacial i l’empaquetament. |