L’augment de soques de Mycobacerium tuberculosis multiresistents i l’aparició de soques extremadament resistents, ha posat de manifest la necessitat de disposar de nous mètodes de detecció precoç de M.tuberculosis i les seves resistències als principals fàrmacs antituberculosos, així com l’estudi eficaç dels brots, per a poder dur a terme un control eficient de la malaltia. L’objectiu de l’estudi va ser determinar la capacitat de la piroseqüenciació per a detectar i identificar micobacteris a partir d’aïllats clínics i mostra directa, determinar el seu patró de resistència a Rifampicina, Isoniacida, Etambutol, Fluoroquinolones, Canamicina i Capreomicina i explorar la seva potencialitat per a ser emprada en el tipatge molecular de les soques. Mitjançant la optimització de la tecnologia de la piroseqüenciació pels gens analitzats, i el disseny de primers específics, hem verificat la utilitat de la piroseqüenciació per al maneig de la tuberculosi. S’ha pogut estudiar la presència de mutacions relacionades amb resistències a fàrmacs de primera línia en el 96.5% de les posicions analitzades en soca clínica i en el 70.4% en mostra directa. Van concordar amb el resultats obtinguts per altres mètodes fenotípics i/o fenotípics el 97.1% i el 98.2% del resultats obtinguts en soca clínica i mostra directa respectivament. La piroseqüenciació ens ha permet analitzar la presència de mutacions relacionades amb resistències a antituberculosos de segona línia, servint com a mètode de confirmació en l’anàlisi d’altres mètodes genotípics. La tècnica ens ha permès també identificar els principals micobacteris no tuberculosos implicats en la infecció humana, sòls o en coinfecció. Resultats preliminars mostren que l’anàlisi amb piroseqüenciació pot ser d’utilitat per l’estudi clonal de les soques de M.tuberculosis. Les nostres observacions mostren la piroseqüenciació com una eina valuosa en l’àmbit clínic, ja que permet una reducció de la demora del diagnòstic, estudi filogenètic i detecció de resistències M.tuberculosis, i per tant una millora de l’aplicació del tractament adequat, ajudant al control de la malaltia.

The outcome of Mycobacterium tuberculosis resistant strains and the emergence of extremely resistant strains, has evidenced the need of new methods for early detection of M.tuberculosis and its resistance to the main antituberculous drugs, as well as effective study outbreaks, in order to carry out efficient control of the disease. The aim of this study was to determine the ability of pyrosequencing to detect and identify mycobacteria from clinical isolates and direct specimens, as well as to determine their pattern of resistance to rifampin, isoniazid, Ethambutol, fluoroquinolones, and Canamicin Capreomicin and to explore its capability to be used in molecular typing of M.tuberculosis. The optimization of pyrosequencing technology for each gene analyzed, and the design of specific primers, allowed us to verify the usefulness of pyrosequencing for the anagement of TB. We were able to study the presence of mutations associated with resistance to first line drugs in 96.5% of the positions analyzed in clinical strains and in 70.4% of direct samples. Results that matched with those obtained by other genotypical and genotypical methods were 97.1% for strains and 98.2% for direct sample. Pyrosequencing allowed us to analyze the presence of mutations associated with resistance second line TB drugs, as a method confirmation method in the analysis of other genotypic methods. The assay also allowed us to identify the main non-tuberculous mycobacteria involved in human infection, alone or in co-infection. Preliminary results showed that pyrosequencing, will allow us to perform the clonal analysis of M.tuberculosis. Our observations show pyrosequencing as a usefull tool in the clinical practice, allowing the reduction of the diagnosis delay, the phylogenetic study and the detection of M.tuberculosis resistance, early improving the anti-TB treatment, in order to help in the disease control.